Molekylærbiologi på Naturfag 2

Molekylærbiologisk institutt, Naturfag 2 8. og 9. november 2017

Lisbeth Charlotte Olsen, zebrafisk som modellorganisme

Modellorganismer er org som kan brukes til å forstå mekanismer i naturen i kontekst. Org har felles genetisk uttrykk, felles genetisk kode. Det vi si at vi kan ta gen fra en bakterie og implementere i et menneske, eller omvendt, og få et uttrykk for egenskapen.
Vi har verktøy for å manipulere den genetiske informasjonen.
Mendel viste at gener opererer i par. Dermed får vi en genotype, hva viser genparet, og en fenotype, hva viser på individet. Det kommer an på om genparet er homozygot eller heterozygot, og om egenskapen er dominant eller recessiv.


Hvordan tolker vi funksjonen til gensekvensene? Flere teknikker:
homologi – sekvenser som er like vil antagelig føre til samme resultat, selv i ulike organismer
revers genetikk, se på funksjon og gå tilbake til genet.

Vi vil knytte funksjoner, for eksempel sykdommer, til gener. To prinsipper: forward or reverse genetics. Studere enten (forward) mutanten og prøve å finne tilbake til genet, eller (reverse) manipulere genomet, riktig gensekvens, og se hvilken mutasjon som oppstår, ut fra prediksjon.
Når man skulle screene hele genomet til en vertebrat ut fra egenskaper, måtte man finne en organisme med kort omløpstid, lett tilgang til embryo. Valget ble sebrafisk. Utvikler larve på bare to døgn. Vi har verktøy for å følge utviklingen, med celledeling og differensiering. Den første screeningen var et enormt arbeid, alle mutasjoner skulle identifiseres tilbake til genene.
I dag kan vi gå andre veien (reverse); injisere DNA i embryoer, og ‘fremkalle’ den mutasjonen vi ønsker. Vi kan følge gensekvenser ci introduserer med fluoriserende protein som følger genet.
I 2001 var hele genomet til mennesket sekvensert og beskrevet. Sebrafisk-genomet var beskrevet i 2013. Fisken har 25 kromosom, 26000 genpar. 70% av genomet er likt menneske.
CRISPR/Cas-systemet: gir oss mulighet til å redigere gener hos mennesket. Man lager da ‘guide-RNA’, tar med seg et enzym som kutter DNA-strengen, slik at du kan sette inn gensekvenser du ønsker. Guide-RNA finner frem til riktig sekvens, og lar deg introdusere det redigerte genet der. Slik kan du redigere og reparerer for eksempel sykdomsgener. CRISPR/Cas er basert på naturlige mekanismer hos bakterier.
Eksempel: det finnes albino sebrafisk. Forskerne har funnet genet med feilen, og vet hva som forsårsaker albinismen. De kan klippe ut gensekvesen, og enten reparere feilen ved å erstatte gensekvensen med en normal, eller sette albino-DNA inn i en normal fisk og videreføre mutasjonen i den.
Man finner 82% av de kjente humane sykdomsgenene i sebrafisk, og derfor kan den brukes til forskning på mange sykdommer. Forsøk av denne typen er regulert av etiske regler, og må søkes om.

Randi Hovland, neste generasjons sekvenseringteknologi i human genetikk

Genetisk undersøkelse ved mistanke om arvelig sykdom. Regulert i bioteknologiloven. Pasienter og pårørende får genetsik veiledning. Analyse for gravide, eller diagnotsik ved sykdom. Strenge regler for å undersøke frsike mennesker, prediktivt.
Etiske dillemmaer, som for eksempel når man oppdager Downs syndrom. Sykdommene man oppdager kan være kromosomsykdommer, enkelt gen-sykdommer (mendelske sykdommer), multifaktorielle sykdommer, mitokondrielle sykdommer. Genene våre ligger i sekvenser på DNA-tråden, med biter mellom som vi ikke kjenner funksjonen til. Under transmisjonen fra DNA til m-RNA kan RNA-et bli satt sammen på ulike måter, gir forskjell mellom proteinsyntesen i ulike organ, kalles alternative splicing. Genuttrykket kan altså variere, med tid og sted og mellom individer.
Hvorfor er vi forskjellige? Millioner av varianter, noen er unike for individet. Variantene må tolkes for å finne hva variasjonene fører til, for eksempel sykdom, en patogen variant. Mendelske sykdommer er en-gen-sydommer, som opptrer når egenskapemn er dominant, eller når et recessivt gen arves fra både mor og far, altså i dobbel dose. Mor og far er da bærere, uten å være syke selv. Vi er bærere av mange sykdommer, det blir ikke gitt informasjon om dette om det blir funnet ved skevensering. Kjønnsbundet arv knyttet til x-kromosomet, kvinner kan være bærere men blir ikke syke, fordi de ikke har dobbel dose x-kromosom. Mennene har dobbel-x, og får sykdommen. Cystisk fibrose er eksemplel på en arvelig, recessiv, sykdom. Mer enn 1500 genetiske varianter kan gi denne syldommen, 1 av 25 i befolkningen er bærer av sykdommen.
Metoder for sekvensering.
PCR, kan lage mange kopier av en sekvens av genet. Sekvensene vi har tatt ut kan vi sammenligne med kjent sekvens, referansesekvens, og se om det er endringer.
Massiv sekvensiell sekvensering, setter til fluoriserende nukleotider, og trekker ut de 1,5% av DNA som koder for proteinet, da har vi hele det humane genomet som vi vet noe om. Også her blir resultatet sammenlignet med referansesekvenser, dataprogrammer leter etter endringer. Forskjeller må så tolkes. Hva så om man finner arvelige sykdommer som det ikke var søkt etter, skal pasienten eller pårørende (foreldre) få vite om sykdomsanlegget? Hva sier lovverket? Det er ikke tilpasset teknologien, som er kommet mye lenger.

Christiane Eichner, forskning på lakselus

Lakselusen hører til crustaceanene, de har altså skallskifte. Gir store økonomiske tap i oppdrettsnæringen. Livssyklusen er på omrent 40 dager. Hundrevis av egg hver time, naupliuslarve, noe få vil treffe på en vertsfisk ute i naturen. I oppdrettsanlegg vil svært mange larver treffe på en fisk. Mange metoder for å bekjempe lakselus, mekanisk og medisinsk. Utvikler resistens mot antibiotika. Lusen må holdes nede, men det er ikke hensikten å utrydde den.
Sea Live Research Centre, CLRC.no, forksningsdrevet innovasjon. Samarbeid mellom universitetende, HI og industripartnere. På molekylærbiologisk institutt dyrkes/avles både lus og laks for å gjøre forsøk. Det er flere grunner for å studere lakselus, den representerer copepodene, som utgjør mye av havets dyreplankton og derfor er en viktig gruppe.
Forksning på lakselusens biologi: Hvilke proteiner er viktige for utvikling, repdoduksjon og overlevelse hos lakselus. Viktige prosesser i livet: finne vert og feste seg, motvirke laksens immnssystem, kunne reprodusere. Studerer skallskifte, mikrobiologi i mikroskop, gensekvensering og sammenligner med andre organismer, lokalisere proteiner. ser på virkningen av knock-down av RNA, altså hemme produksjonen av spesifikke protein ved å interfere med RNA. Dette blir gjort med å injisere dobbelttrådig RNA, som oppfattes som virus-RNA, og bekjempes i cellene. Ser på virkningene, hva fører introduksjonen av d-RNA til fysiologisk? Derfra kan man prøve å slå ut mekanismer som er viktige i livsprosessene, som evnen til å gjenkjenne vertsfisken, evnen til å slå ut laksens immunsforsvar.
Lakselusen er en artropod (leddyr), ytre skjelett, segmenter, skallskifte.
Skallskifte er en sårbar prosess, og den involverer mange prosesser, proteiner og enzymer i kroppen.

Amanda Jayne Edson, CRISPR/cas
Mennesket har 19-23000 gener, etter det vi vet nå.
DNA er dobbeltstregnet, RNA enkelt, RNA koder proteinsyntesen. Hvert kodon på 3 koder for en bestemt aminosyrer, i grupper på 4 kodon, som at CTTT/CTC/CTA/CTG koder for leutein. Vi kan lage mutasjoner i DNA-et, og får en transgen-organisme. Grunnen kan være å studere sykdom, lage vaksiner osv. Early methods were uncertain, expensive and time comnsuming, nort spesific. One method is to expose orgnanisms to UV-radiation. Cloning is another method, you copy a gene and make copies Rekombinant DNA, ta gen fra én orgnisme og implementere den i en anenn, for å få ønsket virkning. ‘Jumping genes’: genes will move from one place in the genom to another.
New age of gene editing:
Guided nucleases, you create a proteing that cuts the DNA-string, duoble-striing-break.
Crispr is the newer, cheaper and better of the DSB-methods.
Crispr fungerer som en DNA-saks, som kutter dobbeltstrengen i DNA; ledet av en bit guide-RNA til riktig plass i genomet. Det tillater oss å manipulere, redigere, DNA, eller undersøke og plassere markører på genomet der vi ønsker. Bruken er ubegreneset, og forhåningene er å utrydde sykdom, skape nye utgaver av dyr, gjenskape utdødde dyrearter eller egenskaper,

Eric Marie Bruno, fluoresencens fantastiske verden
Cellene i kroppen (flere trillioner) er små og gjennomsiktige. Vanskelig å se hva som er inni cellen. Elektronmikroskopet er mye brukt, til scanning (utside) og transmission (inni) viser morfologien. Alle organeller er beskrevet.
Bruken av fluorescens har revolusjonert studiet av cellen, det usynlige blir synlig. Fluorescens oppstår når et atom er blitt belyst slik at et elektron blir eksitert og tar et høyere energinivå, sender ut lys når elektronet går tilbake til det opprinnelige energinivået. Stoffene man bruker mye nå, er DAPI, fluorescein og Rhodamine. Inn i cellen blir det brukt et antiprotein, som binder seg til et bestemt antigen. Antiproteinet kan bære i tillegg et annet antistoff, som har med en fluoriserende markør. Dermed kan du få markert hvor i cellen bestemte protein opptrer. Markørene gir ulil fagre, så du kan få organellene til å lyse opp i ulke farger. for å se de opplyste delee må du ha et spesielt mikroskop, med fargefilter. Teknikken gir mulighet for å studere organismer på celle- og organellnivå. GFP, green fluorescent protein, lyser grønt når det blir utsatt for UV-lys. GFP kommer fra en manet, og er blitt satt inn i andre orgnaismer, og i enkeltceller. Med genteknikk blir GFP klistret på proteinet du vil undersøke, og du kan følge det i organismene selv om det er ‘usynlig’, fordi GFP lyser opp.

Datalab

Zebrafisklab